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NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3活性的影響
【摘要】 研究日本新近研制的第三代3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）還原酶抑制劑匹伐他汀（pitavastatin， NK-104）對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響。方法:采用細胞培養技術，以肝癌細胞系HepG 2為靶細胞，以不同濃度的藥物處理細胞48 h后，利用WST-8法測定NK-104對細胞增殖的影響;利用熒光染料Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡觀察細胞核碎片;以流式細胞儀分析細胞周期的變化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法檢測caspase-3活性。結果:NK-104（10 μmol/L）對HepG 2細胞有明顯抑制作用，可誘導HepG 2細胞凋亡，并能增強caspase-3基因的活性。結論:NK-104能夠誘導HepG 2細胞凋亡，其機制與caspase-3依賴性凋亡調節信號通路有關。【關鍵詞】 肝癌
3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA， HMG-CoA）還原酶抑制劑，統稱為抑制素，是重要的脂類合成抑制劑，主要在人體肝臟中代謝，臨床上廣泛應用于治療高脂血癥［1］。 最近研究發現，HMG-CoA還原酶抑制劑具有生物學多效性，與降血脂無關。有報道其在體外具有抗癌作用［2］、體內與5氟尿嘧啶（fluorouracil， 5-Fu）共同作用能夠延長晚期肝癌患者的生存期［3］。匹伐他汀（pitavastatin， NK-104）是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA還原酶抑制劑［4］。在血管內皮細胞系NK-104通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B， PI3K-Akt）基因激活途徑對內皮細胞的保護作用已有報道［5］，但其在肝癌細胞系的抗癌作用尚未見報道。本文在肝癌細胞系HepG 2通過2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二硫代苯）-2H-四氮唑單鈉鹽 ｛［2-（2-methoxy-4-nitrophe-nyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium， monosodium salt］， WST-8｝、熒光染料Hoechst33258染色、流式細胞儀和半胱氨酸蛋白酶3比色法等檢測方法，研究NK-104對人肝癌細胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）活性的影響，為NK-104在抗腫瘤中的作用機制提供實驗依據。
1 材料和方法
1.1 主要材料與儀器 NK-104，日本興和有限公司（日本名古屋）和日產化學工業公司（日本東京）產品;熒光染料Hoechst 33258、甲羥戊酸（ mevalonic acid， MEV）和碘化丙啶（propidium iodide， PI）染色液（PI 100 g/L， 1% Triton 100， 9 g/L NaCl），Sigma公司產品。流式細胞儀，2000 FCA，美國BD公司產品。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞株HepG 2（美國ATCC公司產品）在含10%胎牛血清的DMEM培養基、5% CO2、37 ℃條件下培養。實驗中，細胞種植于適當培養皿中，90%的細胞融合時，用磷酸鹽緩沖液洗凈后，加入適量含有NK-104和MEV（ 1 mmol/L ）等藥物的培養液，37 ℃培養箱中培養。
1.2.2 WST-8方法 利用WST-8試劑盒對細胞增殖進行測定。HepG 2細胞（1×104個細胞/孔）接種于含100 μl培養液的96孔培養板中，NK-104（ 0.1 ～100 μmol/L）治療48 h后，分別加入WST-8試劑10 μl（日本同仁化學研究所）培養2 h后，選擇450 nm波長，測定各孔的吸光度OD值。
1.2.3 Hoechst 33258染色 細胞經藥物刺激 48 h 后，甲醇-冰乙酸（3∶1）細胞固定液4 ℃固定5 min，磷酸鹽緩沖液稍洗后，點加Hoechst 33258染色液， 10 min 。用濾紙沾去多余液體，封片劑封片后熒光顯微鏡觀察細胞核碎片。
1.2.4 流式細胞儀檢測凋亡峰 在室溫下將刺激48 h后的細胞用冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，并在適當的染色緩沖液中吸取100 μl的細胞（1×105）至試 管中。加入200 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，再加800 μl PI染色液混勻，4 ℃避光30 min后，立即上機分析。
1.2.5 半胱氨酸蛋白酶3比色法 經藥物治療 48 h 后收集細胞，采用半胱氨酸蛋白酶3比色法試劑盒按照廠家說明進行測定（Medical
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