論Nogo受體拮抗劑對大鼠急性脊髓損傷的保護作用

論Nogo受體拮抗劑對大鼠急性脊髓損傷的保護作用

摘要： 目的 探討Nogo受體拮抗劑NEP1-40對大鼠脊髓損傷后脊髓功能恢復的影響，為臨床治療急性脊髓損傷提供實驗依據。方法 健康Wistar大鼠48只隨機分為創傷對照組、NEP1-40治療組。建立大鼠中段胸部脊髓后半部橫切模型。對照組注入生理鹽水，實驗組采用NEP1-40治療。分別在術后取材行蘇木精-伊紅染色、免疫熒光染色檢測。術后第1、3天及1、2、3、4周對動物進行運動功能評分。結果 脊髓損傷3周后，NEP1-40組行為學評分高于對照組，同時NeuN/NF-200陽性染色亦明顯高于對照組，差異有統計學意義。結論 NEP1-40治療脊髓損傷能促進神經元的再生，恢復脊髓功能。

關鍵詞： 大鼠；脊髓損傷；Nogo受體拮抗劑；再生

脊髓少突膠質細胞所分泌的Nogo蛋白是目前已知最強的神經軸突生長抑制因子，對受損神經元再生具有極強的抑制作用［1］。Nogo受體拮抗劑(Nogo extracellular peptide, residues 1-40，NEP1-40)為針對Nogo-66氨基序列設計的Nogo受體(Nogo receptor，NgR)競爭性拮抗劑，能拮抗中樞神經抑制因子與NgR的結合，起到促進神經再生的作用［1-2］。本實驗主要觀察NEP1-40對于急性脊髓損傷大鼠運動功能的影響及對NF-200表達的影響，并進一步探討NEP1-40治療急性脊髓損傷的療效和可能機制。
　　1 材料和方法
　　1.1 主要試劑
　　NEP1-40、兔抗大鼠NeuN 抗體、小鼠抗大鼠NF-200抗體、抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-RBITC，均購自北京博奧森生物技術有限公司。
　　1.2 動物及分組
　　健康成年Wistar大鼠48只(由蘇州大學實驗動物中心提供)， 雌性，體重250～300 g，隨機分為生理鹽水對照組、NEP1-40實驗組。
　　1.3 動物模型的制作
　　參照Brosamle等［3］方法制作脊髓半橫斷模型。大鼠經腹腔麻醉后固定于立體定位儀上，常規消毒，以第8胸椎(T8)棘突為中心，手術顯露棘突。手術顯微鏡下打開T8椎板，用刀片做T10脊髓的后半橫斷，損傷深度1.0 mm（橫斷后側和后外側皮質脊髓束）。向尾側硬脊膜下置入硬脊膜管（PE-10導管，BD公司），鹽水沖洗切口，固定硬脊膜管，依次縫合，模型制作完成。

　　生理鹽水對照組通過置管每天注入生理鹽水20 μl，NEP1-40組每天用微量進樣器注入NEP1-40 10 μl(0.4 μg/μl)。每天分早、中、晚3次注射，每次注射完畢后用10 μl生理鹽水沖管，以保證藥物進入蛛網膜下腔，連續使用4周。術后人工擠壓膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。術后3天給予青霉素4萬U／只。硬脊膜管外口予無菌保護，定期換藥。
　　1.4 標本的收集和處理
　　所有動物均分別于脊髓損傷1、2、3、4周時用4%多聚甲醛經左心室-主動脈灌注后取出脊髓組織，灌注液中固定12 h左右，然后放入30%蔗糖溶液中，待組織沉底，冰凍切片機切片，厚度30 μm。
　　1.5 檢測指標
　　1.5.1 組織學檢查
　　蘇木精-伊紅染色，觀察脊髓的組織學改變。
　　1.5.2 免疫熒光組織化學雙重標記染色
　　選取脊髓切片經兔抗大鼠NeuN 抗體(1∶500)﹑小鼠抗大鼠NF-200抗體(1∶400)4℃孵育過夜，再用抗兔IgG-FITC(1∶100)﹑抗小鼠IgG-RBITC (1∶100)37℃孵育1 h，封片后用Leica激光共聚焦掃描顯微鏡觀察免疫熒光雙標結果。
　　1.6 運動功能評定
　　采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)［4］運動評分法。在80 cm×130 cm×30 cm覆蓋有防滑紙板的箱子中，每只實驗鼠由2名非實驗人獨自觀察4 min，對后肢的運動功能進行評分。0～21分的分級是根據關節的運動、體重的支撐、前后肢的協調和尾的位置等情況而定。0分代表大鼠后肢無運動，21分表示大鼠后肢運動功能正常。BBB評分分別于術后第1、3、7、14、21、28天進行。
　1.7 圖像分析
　　免疫組化染色結果采用德國KONTRONIBAS 2.5全自動圖像分析系統，在損傷的頭尾兩側，分別取10個視野，計算免疫熒光陽性神經細胞數。
　　1.8 統計學處理
　　SAS 9.0統計軟件對數據進行統計學處理，計量數據用±s表示。2組實驗大鼠BBB評分，采用具有一個重復測量的兩因素設計的方差分析，比較不同時點指標的變化趨勢。2組免疫熒光染色陽性反應的比較采用成組設計資料t檢驗。檢驗水準（雙側）：α=0.05。
　　2 結果
　　2.1 組織改變
　　4周時蘇木精-伊紅染色顯示生理鹽水對照組出現神經元固縮、壞死、溶解，細胞體積變小；白質中見較多紅細胞滲出，髓鞘腫脹和大量空泡；并有炎性細胞浸潤和膠質細胞增生。NEP1-40實驗組灰質腫脹變形、出血、小膠質細胞增生和炎性細胞浸潤均較損傷組輕；白質點狀出血，白質中有較多的正常軸突(圖1)。
　　2.2 免疫組化

　　激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到脊髓損傷1、2、3、4周后神經元的胞體和細胞核均增大，胞質和軸突的NF-200免疫染色為陽性，并且與NeuN共定位(圖2)。從NF-200染色陽性神經元數目的統計分析可見，脊髓損傷3周后NEP1-40實驗組明顯高于生理鹽水對照組(P

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