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談大黃提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的消除作用論文
大黃是蓼科大黃屬多年生草本植物掌葉大黃(R.pal?matum)、唐古特大黃(R.palmatum var.tanguticum)或藥用大黃(R.officinale)的根和根莖，其主要有效成分為蒽醌類化合物。蒽醌類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，Ⅱ型豬鏈球菌為一種常見(jiàn)的病原微生物，它在自然界中分布廣泛，可引起人、豬、牛、馬、羊和禽等多種動(dòng)物感染。在人的感染中，豬鏈球菌常導(dǎo)致化膿性腦炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎和眼內(nèi)炎等疾病，是感染生豬飼養(yǎng)人員和屠宰加工人員的常見(jiàn)細(xì)菌。近年來(lái)的研究表明Ⅱ型豬鏈球菌具有形成生物被膜的能力，這會(huì)造成疾病感染的持續(xù)性和徹底治愈的困難，因此尋找和研究藥物對(duì)生物被膜的消除作用對(duì)疾病的治療具有重要的意義。
1 材料與方法
1.1 儀器與設(shè)備
YXQ-LS-50S11 型高壓滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);HZQ-F160 全溫震蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);無(wú)菌凈化工作臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán)空氣技術(shù)有限公司);S-3400N 掃描電鏡(日本);電子天平(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠Sartorius 公司);酶標(biāo)儀(南京華東電子);超聲震蕩儀(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);96 孔板(海門市天龍實(shí)驗(yàn)器材制造廠);6 孔板(海門市天龍實(shí)驗(yàn)器材制造廠)。
1.2 試劑與材料
試劑：THB培養(yǎng)基(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京陸橋技術(shù)有限公司);結(jié)晶紫(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司);冰乙酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司);甲醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司);乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司);磷酸氫二鈉();磷酸二氫鈉()。標(biāo)準(zhǔn)2型豬鏈球菌菌株ATCC700794，購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心;大黃飲片(掌葉大黃(R.palmatum))，購(gòu)于同仁堂藥店。
1.3 方法
1.3.1 大黃水提物的制備
取大黃100 g ，粉成粗粉，加水1L，浸泡過(guò)夜，煎煮1 h，紗布過(guò)濾，濾渣加水500 ml 同法煎煮30 min，紗布過(guò)濾，合并藥液，濃縮，真空干燥，稱重，研成細(xì)粉，即得。
1.3.2 豬鏈球菌生物被膜的培養(yǎng)與觀察
取豬鏈球菌菌株ATCC700794 接種于THB 培養(yǎng)基中，37 培養(yǎng)過(guò)夜，再用THB培養(yǎng)基稀釋菌液濃度為約1.0×106cfu·mL-1，取100μL加入含有無(wú)菌蓋玻片的6孔板，37 培養(yǎng)72 h，取出蓋玻片，滅菌生理鹽水沖洗除浮游菌，戊二醛4固定1 h，0.1mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.2)沖洗兩次后，乙醇脫水，冷凍干燥。樣品表面真空條件下鍍一層厚100～150A的金屬膜，SEM下觀察豬鏈球菌生物被膜形態(tài)。
1.3.3 考察不同濃度大黃提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的消除作用
用96 孔板培養(yǎng)豬鏈球菌生物被膜，并在培養(yǎng)好的96 孔板中分別加入濃度為，31.2 mg/mL,15.6 mg/mL,7.8 mg/mL和3.9 mg/mL 的大黃水提物，37 培養(yǎng)24 h，無(wú)藥組為陰性對(duì)照組。用移液槍棄去96 孔板中的游離菌，滅菌的PBS(pH 7.2)輕輕洗滌三次，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，棄去染色液，PBS(pH 7.2)清洗三次，加入33%的冰乙酸溶液，振蕩器10 min，595nm 處酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值。
1.3.4 考察大黃提取物的不同加入時(shí)間對(duì)豬鏈球菌生物被膜的消除作用
用96 孔板培養(yǎng)豬鏈球菌生物被膜，并在培養(yǎng)好的96 孔板中加入濃度為7.8 mg/mL 的大黃水提物，37 培養(yǎng)不同時(shí)間6 h、12 h 和24 h，無(wú)藥組為陰性對(duì)照組。用移液槍棄去96 孔板中的游離菌，滅菌的PBS(pH 7.2)輕輕洗滌三次，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，棄去染色液，PBS(pH 7.2)清洗三次，加入33%的冰乙酸溶液，振蕩器10 min，595nm 處酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值。
2 結(jié)果與分析
2.1 豬鏈球菌生物被膜的形態(tài)觀察
使用掃描電鏡法觀察豬鏈球菌菌株ATCC700794 培養(yǎng)72 h 后的生物被膜形成狀態(tài)。觀察到大量細(xì)菌粘附于無(wú)菌蓋玻片的表面，且這些細(xì)菌被胞外基質(zhì)如多糖、纖維蛋白、脂蛋白和核酸等物質(zhì)緊密包裹，形成了具有空間結(jié)構(gòu)的團(tuán)塊狀物質(zhì)，而生物被膜是指細(xì)菌被自身所產(chǎn)生的胞外多糖基質(zhì)、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細(xì)胞形態(tài)的結(jié)構(gòu)群落，因此顯示的細(xì)菌形態(tài)表明豬鏈球菌菌株ATCC700794培養(yǎng)72 h后形成了生物被膜。
2.2 不同濃度大黃提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的消除影響
利用TCP 法考察了濃度為31.2 mg/mL,15.6 mg/mL,7.8mg/mL 和3.9 mg/mL 大黃水提物對(duì)對(duì)豬鏈球菌生物被膜的消除影響。
2.3 大黃提取物的作用時(shí)間對(duì)豬鏈球菌生物被膜消除的影響
利用TCP 法考察了濃度為7.8 mg/mL 的大黃水提物與豬鏈球菌生物被膜的作用時(shí)間對(duì)豬鏈球菌生物被膜的消除影響。
3 討論
采用了掃描電鏡法對(duì)豬鏈球菌菌株ATCC700794 生物被膜的形成進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的觀察，以此判定豬鏈球菌生物被膜形成最佳培養(yǎng)條件，試驗(yàn)中還對(duì)培養(yǎng)12 h、24 h 和48 h時(shí)生物被膜的形成情況進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)72 小時(shí)生物被膜形成最佳。
采用TCP法測(cè)定不同濃度大黃提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的消除影響，發(fā)現(xiàn)生物被膜的消除具有劑量依賴性，當(dāng)濃度大于7.8 mg/0mL時(shí)大黃提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜具有良好的消除作用。同時(shí)本研究也對(duì)藥物的作用時(shí)間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)大黃提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜的消除具有時(shí)間依賴性，當(dāng)作用時(shí)間大于12 h 時(shí)，大黃提取物對(duì)豬鏈球菌生物被膜具有良好的消除效果。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為大黃提取物在臨床上的使用提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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